核黃素、煙酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醇高效液相色譜法

本方法適用于保健食品營養補充劑中的核黃素(riboflavin)、煙酸(nicotinic acid)、煙酰胺(nicotinamide)、鹽酸吡哆醇(pyridoxine)的測定。

本方法的最低檢出量：核黃素2.2ng，煙酸8.2ng，煙酰胺6.2ng，鹽酸吡哆醇3.0ng。

1．方法提要

將粉碎均勻的片劑、膠囊或液體樣品用提取液超聲波提取和稀釋，在高效液相色譜儀用C18柱分離，以紫外檢測，用外標法定量。

2．儀器

高效液相色譜儀、紫外檢測器、超聲波提取器、離心機。

3．試劑

(1)甲醇：分析純、色譜純。

(2)乙腈：色譜純。

(3)磷酸：分析純。

(4)1一癸烷磺酸鈉(sodium1-decanesulfonate)離子對試劑。

(5)提取和稀釋液：甲醇+水+磷酸(100+400+0.5)。

(6)核黃素標準儲備液：將標準品核黃素(純度>99％)粉狀結晶置于五氧化二磷干燥器中，24小時后，準確稱取25mg，置于1L棕色容量瓶中，加入1.2ml冰乙酸和750ml水，將容量瓶置于溫水中搖動，待其溶解，冷至室溫，用水稀釋至刻度，于冰箱中保存。

(7)煙酸標準儲備液：準確稱取干燥的標準品煙酸(純度>99％)50.0mg，用水以超聲波助溶并定容至50ml。

(8)煙酰胺標準儲備液：準確稱取干燥的標準品煙酰胺(純度>99％)50.0mg，用水以超聲波助溶并定容至50ml。

(9)鹽酸吡哆醇標準儲備液：準確稱取干燥的標準品鹽酸吡哆醇(純度>99％)50.0mg，用水以超聲波助溶并定容至50ml。

(10)混合標準使用液：臨用前根據樣液被測成分濃度需要，用甲醇+水+磷酸(100+400+0.5)稀釋成混合標準使用液。

4．測定步驟

(1)樣品處理：取20粒以上的片劑或膠囊試樣研磨混勻，稱取一定量(準確至0．001g)，置于100ml棕色容量瓶中，用提取液約60ml超聲波提取5min后，再加提取液至刻度，并稀釋成合適的進樣濃度，經0．45μm濾膜過濾后為樣液(液體試樣可直接用提取液稀釋)。

(2)標準及樣品測定：分別取混合標準使用液和樣品液，在高效液相色譜儀中進樣測定，并記錄相應的峰面積，以外標法定量。

(3)色譜條件

色譜柱：Kromasil C18，250mm×4．6mm，5μm。

流動相：1一癸烷磺酸鈉(1．229溶于850ml水)+乙腈+磷酸(850+150+1)。

檢測波長：280nm。

流速：1．0ml／min。

進樣量：10μl。

5．結果計算

X=(A1×C×V×F)/(A2×m×1000)

式中X——樣品中單一成分的含量[mg／100g(mL)]；

A1——樣品中單一成分峰面積；

c——標準溶液濃度(μg／ml)；

V——樣品定容體積(ml)；

F——樣液稀釋倍數；

A2——標準溶液中單一成分峰面積；

m——樣品質量(g或ml)；

1000——μg換算成mg的換算系數。

6．注釋

(1)本方法出峰順序為核黃素、煙酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醇，由于核黃素出峰居前，要注意樣液中色素(如甜菜紅)的干擾，最好能同時做陰性樣品空白對照。

(2)標準溶液應現配，實驗操作過程應避光。

(3)本方法線性范圍：核黃素0．5～50．0μg／ml，煙酸1．0～100μg／ml，煙酰胺1．0～100μg／ml，鹽酸吡哆醇0．5～50．0μg／ml。

(4)本方法平均回收率：核黃素99．6％，煙酸102．3％，煙酰胺100．3％，鹽酸吡哆醇101．0％。

(5)精密度RSD：核黃素0．46％，煙酸3．2％，煙酰胺1．2％，鹽酸吡哆醇0．62％。

維生素B2、煙酸、煙酰胺、維生素B6標準色譜圖

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